Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4028 (2022) Diesen Artikel zitierenDer Häm-Biosyntheseweg des Malariaparasiten ist für asexuelle Stadien entbehrlich, aber für Mücken- und Leberstadien unerlässlich.Obwohl asexuelle Parasiten über Sicherungsmechanismen verfügen, um Hämoglobin-Häm, Stoffwechselweg-Zwischenprodukte und/oder Enzyme vom Wirt zu erwerben, exprimieren sie Enzyme des Häm-Wegs und synthetisieren Häm.Hier zeigen wir, dass Häm, das in asexuellen Stadien synthetisiert wird, die zerebrale Pathogenese fördert, indem es die Bildung von Hämozoinen verstärkt.Hämozoin ist ein Parasitenmolekül, das mit Entzündungen, abweichenden Immunantworten des Wirts, der Schwere der Erkrankung und der zerebralen Pathogenese in Verbindung gebracht wird.Die Knockout-Parasiten des Hämwegs synthetisieren weniger Hämozoin, und mit Knockout-Parasiten infizierte Mäuse sind vor zerebraler Malaria geschützt und der Tod aufgrund von Anämie wird verzögert.Biosynthetisches Häm reguliert die Integrität der Nahrungsvakuolen und die Nahrungsvakuolen von Knockout-Parasiten werden in pH, Lipidungesättigtheit und Proteinen, die für die Hämozoinbildung wesentlich sind, beeinträchtigt.Angriff auf die Häm-Synthese von Parasiten durch Griseofulvin – ein von der FDA zugelassenes Antimykotikum – verhindert zerebrale Malaria bei Mäusen und bietet eine ergänzende therapeutische Option für zerebrale und schwere Malaria.Malaria bleibt ein großes Problem für Morbidität und Mortalität, insbesondere angesichts der aufkommenden Parasitenresistenz gegen Artemisinin-basierte Kombinationstherapien (ACTs) und Mückenresistenz gegen Insektizide1.Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) traten im Jahr 2020 241 Millionen Fälle und 627.000 Todesfälle durch Malaria auf. Von den fünf Plasmodium-Arten, die Malaria beim Menschen verursachen, ist Plasmodium falciparum (Pf) die tödlichste und für mehr als 90 % der Infektionen verantwortlich.Die klinischen Manifestationen der Pf-Malaria variieren von leicht (unkomplizierte Malaria) bis schwer (komplizierte Malaria).Die unkomplizierte Malaria ist durch Fieber, Kopfschmerzen, Übelkeit, Schüttelfrost und leichte Anämie gekennzeichnet.Komplizierte Malaria wird durch das Vorhandensein mindestens eines Kriteriums der Schwere der Erkrankung kategorisiert, das Atemnot, metabolische Azidose, Lungenödem, schwere Anämie, Gelbsucht, Nierenversagen oder neurologische Komplikationen wie Bewusstseinsstörungen, Krämpfe usw. umfasst. Das typische Ergebnis einer schweren Malaria ist Multiorganversagen und/oder zerebrale Malaria (CM), von denen CM die schwerste neurologische Komplikation mit hoher Sterblichkeit ist.Etwa ein Drittel der Patienten, die sich von CM erholen, zeigen langfristige neurokognitive Beeinträchtigungen2,3,4.Unser aktuelles Verständnis von CM stammt aus einigen Post-Mortem-Studien mit menschlicher CM (HCM) und einer großen Anzahl experimenteller CM-Studien (ECM), die in Mausmodellen durchgeführt wurden5,6.Obwohl Nagetierparasiten Orthologe für Pf Erythrozytenmembranprotein 1 fehlen – eine Proteinfamilie, die zur RBC-Membran transportiert wird und hauptsächlich mit der Sequestrierung von Parasiten in Verbindung gebracht wird, bleiben die molekularen Mechanismen und zellulären Mechanismen, die der zerebralen Pathogenese und Parasitenvirulenz zugrunde liegen, konserviert7.Es gab frühere Diskrepanzen über das Ausmaß der Verwendung von ECM als Modell für HCM, insbesondere im Zusammenhang mit der Sequestrierung von parasitierten RBCs (pRBCs) in Mikrovaskulatur des Gehirns.HCM ist gekennzeichnet durch eine starke Zytoadhärenz und dichte Sequestrierung einer großen Anzahl von pRBCs, die beträchtliche Längen der zerebralen Mikrovaskulatur blockieren können8, im Gegensatz zu einer unregelmäßigen Verteilung von pRBCs in ECM, die mechanisch gefangen zu sein scheinen9,10.Mehrere Studien haben jedoch signifikante Analogien zwischen HCM und ECM in Bezug auf die zerebrale und neurovaskuläre Pathologie nahegelegt.Es besteht Konsens über die erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BBB), Verschlüsse der Gehirnkapillaren, die Ansammlung parasitärer roter Blutkörperchen (pRBCs) in den Mikrogefäßen des Gehirns, die Leukozyteninfiltration und die Endothelaktivierung mit dysregulierter Entzündung und abweichenden Immunantworten des Wirts.All dies führt zu Störungen der BHS, intrazerebralen Blutungen, Ischämie, Ödemen, erhöhtem Hirndruck, axonaler Schädigung und Demyelinisierung, was in einer Funktionsstörung des zentralen Nervensystems gipfelt5,6,11.Die zerebrale Pathologie entsteht aufgrund eines komplexen Zusammenspiels molekularer Ereignisse, die durch verschiedene Wirts- und Parasiten-abgeleitete Faktoren ausgelöst werden.Das synchrone Wachstum der asexuellen Parasiten in roten Blutkörperchen (RBCs) und die damit verbundene Schizogonie führen zur Freisetzung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) wie Hämozoin (Hz), Glycosylphosphatidylinositiol, Parasiten-DNA und -RNA und mit Gefahren assoziierten Molekülen Muster (DAMPs) wie Häm, Harnsäure und extrazelluläre Vesikel12,13.Hz und sein Vorläufer Häm spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von CM14,15,16,17,18,19,20,21.Die Parasiten im asexuellen Stadium endozytieren Hämoglobin (Hb) und verdauen es in der Nahrungsvakuole (FV).Das toxisch freie Häm, das während dieses Prozesses freigesetzt wird, wird durch das Häm-Entgiftungsprotein (HDP), das einem umständlichen Transport unterliegt und im infizierten Erythrozyten-Cytosol reichlich vorhanden ist, als Parasiten-FVs in Hz entgiftet22.Obwohl die Rate der HDP-vermittelten Hz-Bildung viel höher ist, wurden auch autokatalytische23, histidinreiche Protein (HRP)-vermittelte24 und Lipid-getriebene Mechanismen25,26 für die Hz-Bildung beschrieben.Es besteht eine positive Korrelation von Hz, das in den Kreislauf freigesetzt und von den zirkulierenden Fresszellen phagozytiert wird, mit der Schwere der Erkrankung bei Kindern und Erwachsenen27,28,29.In ähnlicher Weise wird plasmafreies Häm mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebracht30,31.Freies Häm ist für Endothelzellen zytotoxisch und kann die Expression von Adhäsionsmolekülen erhöhen, die NLRP3-Inflammasom- und IL-1β-Sekretion induzieren und polymorphkernige Zellen aktivieren.Die einzige Behandlungsoption für CM ist die parenterale Verabreichung von Artemisinin-Derivaten oder Chinin mit unterstützenden Therapien.Die Sterblichkeit durch CM bleibt jedoch trotz der Parasitenbeseitigung hoch2,3,4,32.Die molekularen Mechanismen, die der CM-Pathogenese zugrunde liegen, müssen für die Entwicklung von Begleittherapien verstanden werden.Malaria-Parasiten synthetisieren Häm de novo trotz der Fähigkeit asexueller Stadien, auf das Hb-Häm des Wirts zuzugreifen33.Der Parasiten-Häm-Weg ist in Mitochondrium, Apicoplast und Cytosol unterteilt, und Häm wird schließlich im Mitochondrium synthetisiert.Unsere frühere Studie mit P. berghei (Pb) Aminolävulinat-Synthetase (ALAS) und Ferrochelatase (FC) Knockouts (KOs), die für das erste und letzte Enzym erzeugt wurden, zeigte, dass der Parasitenweg für das Wachstum in asexuellen Stadien entbehrlich, aber für die Entwicklung unerlässlich ist von Sporozoiten in Mücken und präerythrozytäre Stadien in der Leber.Darüber hinaus können FCKO-Parasiten das Hb-Häm des Wirts für ihr Überleben in Blutstadien nutzen34,35.Nachfolgende Studien in Pf unter Verwendung von KO-Parasiten, die für ALAS, FC, Apicoplast-lokalisierte Porphobilinogen-Deaminase und Cytosol-lokalisierte Coproporphyrinogen-Oxidase erzeugt wurden, bestätigten diese Ergebnisse mit dem Hinweis, dass extrazelluläres ALA, das über neue Permeabilitätswege erworben wurde, auch zur Parasiten-Häm-Synthese führen kann36,37.Die Umwandlung von extrazellulärer ALA in Protoporphyrin IX erfolgt in RBCs mit Hilfe von Wirtsenzymen, und Häm wird von Parasiten-FC synthetisiert.Obwohl die De-novo-Häm-Synthese nicht essentiell ist und die asexuellen KO-Parasiten Häm/Häm-Vorläufer von Wirts-RBCs erwerben und einige der Wirtsenzyme importieren können, werden die Parasitenenzyme exprimiert und die Häm-Synthese findet statt, wie aus der 13C/14C-ALA-Stoffwechselmarkierung hervorgeht Studien34,35,36,37,38,39,40,41.Wir stellten die Hypothese auf, dass der De-novo-Hämweg des Parasiten eine physiologische Relevanz in den asexuellen Stadien haben sollte.Hier zeigen wir, dass de novo Häm die ECM-Pathogenese induziert, indem es die Hz-Bildung in den asexuellen Stadien reguliert und damit eine Antwort auf eine seit langem bestehende Frage bietet.Wir bieten außerdem eine ergänzende therapeutische Option auf der Grundlage, dass Griseofulvin – ein bekanntes, von der FDA zugelassenes Medikament, das in der Lage ist, die Hämsynthese von Parasiten zu hemmen – ECM bei Mäusen verhindern kann.Unsere frühere Arbeit mit Pb-Häm-Stoffwechselweg-KO-Parasiten wurde an ausgezüchteten Schweizer Mäusen durchgeführt, die kein ECM34 entwickeln.Hier führten wir unsere Studien am ECM-anfälligen C57BL/6-Inzucht-Mausstamm durch, indem wir 105 Parasiten im asexuellen Stadium injizierten.Die Beurteilung der Parasitämie im peripheren Blut zeigte eine Verzögerung von 2–3 Tagen im Wachstum von KO-Parasiten im Vergleich zum WT (Abb. 1a).Wichtig ist, dass etwa 80 % der WT-infizierten Mäuse innerhalb von Tag 10 der ECM erlagen, als die Blutparasitämie etwa 10–30 % betrug.Die WT-infizierten Mäuse, die der ECM entkommen waren, starben am 12.–16. Tag nach der Infektion an Anämie.Im Gegensatz dazu waren mit ALASKO- und FCKO-Parasiten infizierte Mäuse vor ECM geschützt und starben am 20.–30. Tag an Anämie (Abb. 1b).Die Verzögerung des Wachstums von KO-Parasiten war mit einem frühen Anstieg des Milzgewichts infizierter Mäuse verbunden (Abb. 1c), was auf eine bessere Milzclearance hindeutet.Eine ähnliche Verzögerung des Wachstums von KO-Parasiten und der Sterblichkeit von KO-infizierten Mäusen aufgrund von Anämie wurde bei Balb/c-Mäusen beobachtet, die keine ECM entwickeln (Ergänzende Abb. 1a, b).Es ist bekannt, dass sich das Wachstum von KO-Parasiten des Hämwegs leicht in Bezug auf den genetischen Hintergrund von Mäusen (Inzucht/Auszucht) unterscheidet, und eine ähnliche Wachstumsverzögerung wird auch für andere KO-Parasiten des Hämwegs berichtet34,42,43.Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der ECM-Schutz auf eine Verzögerung des Anstiegs der Blutparasitämie zurückzuführen ist, führten wir Wachstumsanalysen bei C57BL/6-Mäusen durch, die mit 107 ALASKO/FCKO-Parasiten infiziert waren.Während das Wachstum von 107 KO-Parasiten bei Mäusen mit 105 WT-Parasiten vergleichbar war, waren KO-infizierte Mäuse erneut vor ECM geschützt (Abb. 1d, e).Die Sterblichkeit aufgrund von Anämie wurde um 6–10 Tage verzögert, und KO-infizierte Mäuse konnten über einen längeren Zeitraum eine höhere Parasitämie erleiden.Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Präferenz von Retikulozyten gegenüber reifen Erythrozyten zwischen WT- und KO-Parasiten in den ersten 9 Tagen, der Dauer, in der die ECM-Mortalität bei WT-infizierten Mäusen auftrat.KO-Parasiten zeigten jedoch eine signifikant erhöhte Retikulozytenpräferenz und mehrere Infektionen in den Retikulozyten während des späteren Verlaufs von Infektionen, die eine anämische Phase darstellen (Abb. 1f, g).Der RMCBS-Score (Rapid Murine Coma and Behavioral Scale) von 105 mit WT-Parasiten infizierten Mäusen, die an ECM starben, lag an Tag 7 unter 5, während der RMCBS-Score von 107 mit KO-Parasiten infizierten Mäusen an Tag 7 und 14 bei etwa 17 und 14 lag. (Abb. 1h).Für alle nachfolgenden Experimente initiierten wir asexuelle Infektionen, indem wir 105 WT- und 107 ALASKO/FCKO-Parasiten injizierten.a Wachstumsanalyse von PbWT- (n = 10), PbALASKO- (n = 12) und PbFCKO- (n = 12) Parasiten in C57BL/6-Mäusen.105 Parasiten wurden verwendet, um PbWT- und PbKO-Parasiteninfektionen auszulösen.Die Daten repräsentieren drei verschiedene Chargen.(Mittelwert ± SD; ***P < 0,001, Zweiweg-ANOVA).b Mortalitätskurven von mit PbWT-, PbALASKO- und PbFCKO-Parasiten infizierten Mäusen.Die Daten stellen die Mäuse dar, die für die Wachstumskurvenanalyse verwendet wurden (***P < 0,001, Log-Rank (Mantel-Cox)-Test).c Milzgewicht von mit PbWT- (n = 13), PbALASKO- (n = 14) und PbFCKO- (n = 14) Parasiten infizierten Mäusen.Für jeden Tag wurden 3–5 Mäuse aus mindestens drei verschiedenen Chargen eingeschlossen (Mittelwert ± SD; * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, Zweiweg-ANOVA).Maßstabsleiste = 1 cm.d Wachstumsanalyse von PbWT- (n = 14), PbALASKO- (n = 14) und PbFCKO- (n = 14) Parasiten in C57BL/6-Mäusen.105 und 107 Parasiten wurden verwendet, um WT- bzw. KO-Parasiteninfektionen auszulösen.Die Daten repräsentieren vier verschiedene Chargen (Mittelwert ± SD; ns nicht signifikant, Zweiweg-ANOVA).e Mortalitätskurven von mit PbWT-, PbALASKO- und PbFCKO-Parasiten infizierten Mäusen.Die Daten stellen die Mäuse dar, die für die Wachstumskurvenanalyse verwendet wurden (***P < 0,001, Log-Rank (Mantel-Cox)-Test).f Prozentsatz infizierter Retikulozyten in den parasitierten Erythrozyten (Mittelwert ± SD; *P < 0,05, ***P < 0,001, Zweiweg-ANOVA).Die Daten repräsentieren jeweils sechs Mäuse für PbWT-, PbALASKO- und PbFCKO-Parasiten.g Giemsa-gefärbte Bilder für periphere Blutausstriche, die aus Schwanzvenenblut von mit PbWT- und PbKO-Parasiten infizierten Mäusen hergestellt wurden.Retikulozyten konnten durch ihre deutliche blaue Farbe identifiziert werden.Die Bilder wurden mit einem 100x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsbalken = 5 μm.n = 4–6 unabhängige Experimente.h RMCBS-Score für mit PbWT- (n = 8) und PbKO- (n = 12) Parasiten infizierte Mäuse.PbWT-Daten stellen die Mäuse dar, die der ECM erlagen (Mittelwert ± SD; ***P < 0,001, ungepaarter t-Test; zweiseitig).Für (a, c, d, f) sind einzelne Datenpunkte mit den jeweiligen hell schattierten Farben dargestellt.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Diese Ergebnisse wurden mit einem anderen Satz unabhängiger PbKOLuc-Parasitenlinien verifiziert, bei denen ALAS- und FC-Gene einzeln durch GFP-Luciferase (Luc)-exprimierende Kassetten ersetzt wurden, die m-Kirsche enthielten (Fig. 2a).Der erfolgreiche Ersatz von ALAS und FC wurde durch PCR-Analysen bestätigt, die mit DNA und RNA durchgeführt wurden, die aus den jeweiligen PbKOLuc-Parasiten isoliert wurden (Abb. 2b, c), und durch Untersuchung der GFP- und m-Cherry-Fluoreszenz (Abb. 2d).Zur Kontrolle wurde der c-ssurRNA-Lokus im WT-Parasiten durch eine GFP-Luc-exprimierende Kassette mit m-Kirsche (PbControlLuc) ersetzt.Die ortsspezifischen Integrationen in PbControlLuc- und PbKOLuc-Parasiten wurden auch durch PCR-Analysen bestätigt (ergänzende Abb. 1c – e).In-vivo-Biolumineszenzstudien zeigten eine Akkumulation von pRBCs im Gehirn von PbControlLuc-infizierten Mäusen, aber nicht in den PbKOLuc-infizierten Mäusen (Abb. 2e), und dies wurde auch durch Ex-vivo-Bildgebung bestätigt (Abb. 2f).Die mit PbKOLuc-Parasiten infizierten Mäuse waren vor ECM geschützt (Abb. 2g).Um einen Off-Target-Effekt auszuschließen, führten wir eine genetische Komplementierung in PbFCKOLuc durch, indem wir FC (PbFCKO + FC) wieder einführten, das unter seinem nativen Promotor durch stabile Integration exprimiert wurde (ergänzende Abb. 1f).Die erfolgreiche Komplementierung von FC wurde durch PCR- und Western-Analysen verifiziert (ergänzende Abb. 1g – i).PbFCKO+FC-Parasiten verhielten sich wie WT-Parasiten und verursachten ECM bei den infizierten Mäusen (Abb. 2h–j).Diese Daten legen nahe, dass die mit KO-Parasiten des Hämwegs infizierten Mäuse vor ECM geschützt sind.eine Double-Crossover-Rekombinationsstrategie zur Erzeugung von Luc-exprimierenden Parasiten PbALASKO (PbALASKOLuc) und PbFCKO (PbFCKOLuc).Schwarze Pfeile stellen die Position von Primern dar, die zur Bestätigung der ortsspezifischen Integration in PbKOLuc-Parasiten verwendet werden (Daten in ergänzender 1).b Genomische DNA-PCR-Bestätigung für ALAS- und FC-Deletionen in PbALASKOLuc- bzw. PbFCKOLuc-Parasiten.Spur M: 1-kb-Leiter;Spur 1, 3 und 5: ALAS-Produkt (2,11 kb);Spur 2, 4 und 6: FC-Produkt (1,54 kb).n = 3 unabhängige Experimente.c RT-PCR-Bestätigung für ALAS- und FC-Deletionen.Spur M: 1-kb-Leiter;Spur 1, 3 und 5: ALAS-Produkt (1,92 kb);Spur 2, 4 und 6: FC-Produkt (1,05 kb).n = 3 unabhängige Experimente.d Live-GFP und m-Cherry-Fluoreszenz von PbControlLuc- und PbKOLuc-Parasiten.Die Bilder wurden mit einem 100x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsbalken = 5 μm.n = 4 unabhängige Experimente.e Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung von PbControlLuc- und PbKOLuc-Parasiten-infizierten Mäusen am Tag 8 nach der Infektion.n = 3 unabhängige Experimente.f Ex-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Leber (Li), Lunge (Lu), Gehirn (B), Herz (H) und Milz (S) von PbControlLuc- und PbKOLuc-infizierten Mäusen.Vergrößerte Bilder des Gehirns werden gezeigt.g Mortalitätskurven von Mäusen, die mit den Parasiten PbControlLuc (n = 5), PbALASKOLuc (n = 4) und PbFCKOLuc (n = 5) infiziert waren (***P < 0,001, Log-Rank (Mantel-Cox)-Test).h Wachstumsanalyse der Parasiten PbWT (n = 6), PbFCKO+FC (n = 6) und PbFCKOLuc (n = 5) in weiblichen C57BL/6-Mäusen.Die Daten stellen zwei verschiedene Chargen dar (Mittelwert ± SD; ns nicht signifikant, Zweiweg-ANOVA).Einzelne Datenpunkte werden mit den jeweiligen hell schattierten Farben dargestellt.i Mortalitätskurven von mit PbWT- (n = 6), PbFCKO+FC- (n = 6) und PbFCKOLuc- (n = 5) Parasiten infizierten Mäusen (ns nicht signifikant, ***P < 0,001, Log-Rank (Mantel-Cox) Prüfung).j RMCBS-Score für mit PbWT- (n = 6), PbFCKO+FC- (n = 6) und PbFCKOLuc- (n = 5) Parasiten infizierte Mäuse am Tag 7/8 nach der Infektion.PbWT- und PbFCKO+FC-Daten stellen die Mäuse dar, die ECM erlagen (Mittelwert ± SD; ns – nicht signifikant, ***P < 0,001, ungepaarter t-Test; zweiseitig).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Um die Integrität der BBB zu bewerten und die Gefäßleckage zu beurteilen, wurden Evans-Blau-Paravasationsanalysen durchgeführt.Während das von WT-infizierten Mäusen am Tag 7/8 gesammelte Gehirn sich intensiv mit Evans-Blau färbte, war die Extravasation von Evans-Blau in das Gehirn bei KO-infizierten Mäusen an Tag 7 und 14 kaum nachweisbar (Abb. 3a).Die Quantifizierung von Evans-Blau in den Gehirnextrakten bestätigte diese Beobachtung (Abb. 3b).Die histopathologische Beurteilung von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Gehirnschnitten von WT-infizierten Mäusen an Tag 7 zeigte intrazerebrale Blutungen mit Extravasation von Erythrozyten in den perivaskulären Raum, Petechienblutungen, thrombosierte und mit Leukozyten gefüllte Gefäße, starke Demyelinisierung und Myelinblässe.In den Gehirnschnitten von KO-infizierten Mäusen konnten keine derartigen charakteristischen Merkmale von ECM nachgewiesen werden (Abb. 3c).Immunhistochemische Studien, die mit den Gehirnschnitten von WT-infizierten Mäusen durchgeführt wurden, zeigten die Extravasation von IgG in das Hirnparenchym und das Vorhandensein von IgG in verschlossenen Gefäßen und Blutungen, aber nicht in den KO-infizierten Mäusen ( 3d ).Luminale und abluminale Leukozyten und von Parasiten stammende Hz konnten in den verschlossenen Gefäßen von WT-infizierten Mäusen nachgewiesen werden.(Abb. 3e).Immunfluoreszenzanalysen der Gehirnschnitte mit Pb-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Maus-CD31-Antikörpern zeigten die Akkumulation von Parasiten in CD31+-Gefäßen und extravaskulären Parasiten in den Blutungen von WT-infizierten Mäusen, aber nicht in den KO-infizierten Mäusen ( Abb. 3f).In ähnlicher Weise zeigten Antikörper, die für CD3 und β-Amyloid-Vorläuferprotein (β-APP) spezifisch sind, die Akkumulation von CD3+-T-Zellen in den zerebralen Gefäßen (Fig. 3g) und axonale Verletzungen in den Gehirnschnitten von WT-infizierten Mäusen, aber nicht in den KO-infizierte Mäuse (Abb. 3h).Diese Daten deuteten auf das Fehlen von ECM-assoziierten Hirnläsionen bei Mäusen hin, die mit KO-Parasiten des Hämwegs infiziert waren.a Evans-Blau-Extravasation im Gehirn von Mäusen, die mit PbWT- und Hämweg-PbKO-Parasiten infiziert sind.b Quantifizierung von Evans-Blau in Gehirnproben von Mäusen, die mit PbWT- (n = 6) und Hämweg-PbKO- (n = 9) Parasiten infiziert waren.(Mittelwert ± SD; ***P < 0,001, ungepaarter t-Test; zweiseitig).c H&E-Färbung der Gehirnschnitte, die von mit PbWT- und PbKO-Parasiten infizierten Mäusen präpariert wurden.Schwarze Pfeile – intrazerebrale und petechiale Blutungen, blaue Pfeile – thrombosierte Blutgefäße und braune Pfeile – starke Demyelinisierung.Die Bilder wurden mit einem 10x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsleiste = 50 μm.n = 3–5 unabhängige Experimente.d IgG-Extravasation in Gehirnschnitten von PbWT- und PbKO-Parasiten-infizierten Mäusen.Schwarze Pfeile – Bereiche, die IgG-Immunreaktivität zeigen.Die Bilder wurden mit einem 10x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsleiste = 50 μm.n = 3 unabhängige Experimente.e H&E-Färbung der Gehirnschnitte, die auf (schwarze Pfeile) verschlossene Gefäßsysteme hinweisen, die luminale und abluminale Leukozyten und von Parasiten stammende Hz enthalten.Die Bilder wurden mit einem 60x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsleiste = 10 μm.n = 3 unabhängige Experimente.f Immunfluoreszenzanalyse der Parasitenansammlung in Gehirnschnitten von PbWT- und PbKO-Parasiten-infizierten Mäusen.n = 3 unabhängige Experimente.g Immunfluoreszenzanalyse von CD3+-Zellen in den Blutgefäßen von PbWT- und PbKO-Parasiten-infizierten Mäusen.n = 2 unabhängige Experimente.h Immunfluoreszenzanalyse der β-APP-Färbung in Gehirnschnitten von PbWT- und PbKO-Parasiten-infizierten Mäusen.n = 2 unabhängige Experimente.f–h Die Bilder wurden mit einem 20x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsleiste = 20 μm.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Multiplex-Assays, die an Tag 8 für mit KO-Parasiten infizierte Mäuse durchgeführt wurden, zeigten eine signifikante Abnahme der Plasmaspiegel von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen – IL-6, TNFα, IFNγ, G-CSF, CCL3 (MIP-1α) und CCL5 (RANTES).Es gab auch einen signifikanten Anstieg der entzündungshemmenden Zytokine – IL-4, IL-10 und IL-13 (Abb. 4a).Quantitative RT-PCR-Analysen, die die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Chemokinrezeptoren und anderen wichtigen Mediatoren der zerebralen Pathogenese in den Gehirnproben von KO-infizierten Mäusen untersuchten, zeigten eine erhebliche Verringerung der Transkriptspiegel von TNFα, IFNγ, CXCL9 um das >1,5-fache. CXCL10, CCL2 (MCP-1), CCL5, CCL19, Perforin, Granzym B, ICAM-1, p-Selektin und HO-1.Insbesondere war die Abnahme von IFNγ, CXCL10, CCL2, CCL5, Granzym B, ICAM-1 und HO-1 in FCKO größer als das Dreifache (Fig. 4b).Durchflusszytometrische Analysen der Leukozyten, die aus Gehirnproben von KO-infizierten Mäusen isoliert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion von CD3+ CD4+ und CD3+ CD8+ doppelt positiven T-Zellen und CD3+ CD8+ CD69+, CD3+ CD8+ CXCR3+, CD3+ CD8+ Perforin+, CD3+ CD8+ Granzym B+, CD3+ CD8+ TNFα+ und CD3+ CD8+ IFNγ+ dreifach positive T-Zellen (Abb. 4c und ergänzende Abb. 2).Western-Analysen für die Gehirnhomogenate von KO-infizierten Mäusen zeigten eine Verringerung von Phospho-NLRP3, Phospho-NF-κB, gespaltener Caspase-1 und IL-1β (Fig. 4d).Die RNA-Spiegel des schizonten membranassoziierten Cytoadherence-Proteins (SMAC), des skelettbindenden Proteins 1 (SBP1) und des membranassoziierten histidinreichen Proteins 1a (MAHRP1a), das die Sequestrierung und Cytoadhärenz in Pb vermittelt, waren zwischen WT- und FCKO-Parasiten vergleichbar (ergänzende Abb 3a).Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der In-vitro-Cytoadhärenz von PbControlLuc- und PbFCKOLuc-pRBCs an TNFα-vorstimulierten Endothelzellen des Mausgehirns (ergänzende Fig. 3b, c).Diese Daten legen nahe, dass, obwohl die der Zytoadhärenz zugrunde liegende Parasitenmaschinerie erhalten bleibt, Mäuse, die mit KO-Parasiten des Hämwegs infiziert sind, eine verringerte In-vivo-Sequestrierung aufgrund einer allgemeinen Abnahme der systemischen und neuronalen Entzündung und der T-Zell-Infiltration im Gehirnmilieu zeigen.a Zytokin- und Chemokinspiegel im Plasma von PbWT- und PbKO-infizierten Mäusen (n = 5) (Mittelwert ± SD; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ungepaarter t-Test; zweiseitig ).b qPCR-Analysen von Wirts-Transkripten in Gehirnproben infizierter Mäuse.Die Expressionsniveaus wurden mit Maus-GAPDH normalisiert.Relative Expressionsfaltenänderungen von mRNA-Transkripten in den KO-infizierten Mäusen in Bezug auf WT-infizierte Mäuse (Mittelwert ± SD) sind gezeigt (n = 3).c Durchflusszytometrische Analysen von T-Zellen in Gehirnproben infizierter Mäuse.Es wurden Mäuse am Tag 7/8 nach der Infektion verwendet und die Daten für jeden Zelltyp wurden von mindestens drei verschiedenen Mäusen erhalten, die mit PbWT- oder PbKO-Parasiten infiziert waren (Mittelwert ± SD; ***P < 0,001, Zweiweg-ANOVA).Einzelne Datenpunkte werden als schwarze Kreise dargestellt.Die Gating-Strategie und repräsentative durchflusszytometrische Diagramme sind in der ergänzenden Abb. 2 dargestellt. d Western-Analysen von Gehirnhomogenaten, die aus PbWT- und PbKO-infizierten Mäusen hergestellt wurden.200 μg Gesamtprotein wurden aus den gepoolten Gehirnhomogenaten von drei verschiedenen Mäusen für PbWT, PbALASKO und PbFCKO verwendet.n = 2 unabhängige Experimente.Blots in voller Länge sind in der ergänzenden Fig. 7 bereitgestellt. Quelldaten werden als eine Quelldatendatei bereitgestellt.In den Giemsa-gefärbten peripheren Blutausstrichen von KO-Parasiten wurde eine wesentliche Abnahme der Hz-Bildung beobachtet.Dies war in den asexuellen Stadien (Abb. 5a) stärker ausgeprägt als in Gametozyten (Abb. 5b) und konnte in fast 60–70 % der pRBCs mit asexuellen Stadien leicht nachgewiesen werden.Diese Ergebnisse wurden durch Untersuchung des Hz-Gehalts in Paraformaldehyd-fixierten roten Blutkörperchen (Abb. 5c) und der Hz-Dynamik in lebenden roten Blutkörperchen (Supplementary Movie 1, Supplementary Movie 2 und Supplementary Movie 3) verifiziert.Zur Bestätigung wurde der gesamte Hz-Gehalt der KO-Parasiten, normalisiert in Bezug auf das Protein, untersucht und betrug 20–25 % des WT (Abb. 5d).Während der Hz-Bildung im FV kann Häm in das Cytosol des Parasiten auslaugen.Freies Häm in den Parasitenlysaten der KO-Parasiten, die durch hypotonische Lyse hergestellt wurden, zeigte eine Abnahme von etwa 55 % im Vergleich zu WT (Fig. 5e).Darüber hinaus gab es eine signifikante Abnahme von etwa 55–60 % des plasmafreien Häms und des Häm/Hämopexin-Verhältnisses der KO-infizierten Mäuse (Abb. 5f, g).Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Plasma-Hämopexin-Spiegeln von WT- und KO-infizierten Mäusen (Abb. 5h), und es gab eine 15–20%ige Abnahme der Plasma-Hb-Spiegel, die im Falle von FCKO statistisch signifikant war, aber nicht in ALASKO (Abb. 5i).Die Quantifizierung der Hz-Belastung in Milz und Leber zeigte eine Abnahme von 40–50 % bei den KO-infizierten Mäusen (Abb. 5j, k).Eine ähnliche Abnahme des Hz-Gehalts und des freien Häms wurde bei den aus Balb/c-Mäusen isolierten KO-Parasiten beobachtet (ergänzende Abb. 3d, e).Diese Ergebnisse deuteten auf eine allgemeine Abnahme der Hz-Synthese von KO-Parasiten hin.Dies wurde weiter verifiziert durch die Wiederherstellung der Hz- und freien Häm-Spiegel bei PbFCKO+FC-Parasiten, die aus C57BL/6-Mäusen isoliert wurden (ergänzende Abb. 3 f–h) und das Vorhandensein einer zerebralen Pathogenese bei den PbFCKO+FC-infizierten Mäusen (ergänzende Abb 3i–k).a, b Hellfeldbilder von Giemsa-gefärbten PbWT-, PbALASKO- und PbFCKO-Parasiten im asexuellen Stadium bzw. Gametozyten, die den Hz-Gehalt zeigen.Die Bilder wurden mit einem 100x-Objektiv aufgenommen.n = 3–5 unabhängige Experimente.Maßstabsbalken = 5 μm.c Hz-Gehalt in differentiellem Interferenzkontrast (DIC; links) und Hellfeldbildern (rechts) von Paraformaldehyd-fixierten pRBCs, die PbWT- und PbKO-Parasiten enthalten.Die Bilder wurden mit einem 100x-Objektiv aufgenommen.Maßstabsbalken = 5 μm.n = 3 unabhängige Experimente.d Hz-Pegel bei PbWT- (n = 12) und PbKO- (n = 10) Parasiten.e Gehalte an freiem Häm bei PbWT- (n = 11) und PbKO- (n = 10) Parasiten.f Gehalte an freiem Häm in den Plasmaproben von mit PbWT (n = 12) und PbKO (n = 11) mit Parasiten infizierten Mäusen.g Häm/Hämopexin-Verhältnis in den Plasmaproben von mit PbWT (n = 12) und PbKO (n = 10) mit Parasiten infizierten Mäusen.h Plasma-Hämopexinspiegel von mit PbWT (n = 13) und PbKO (n = 11) mit Parasiten infizierten Mäusen.i Plasmahämoglobinspiegel von mit PbWT (n = 13) und PbKO (n = 11) mit Parasiten infizierten Mäusen.j, k Hz Belastung in Milz und Leber von mit PbWT (n = 14) bzw. PbKO (n = 9 für ALASKO; n = 13 für FCKO) mit Parasiten infizierten Mäusen.d–k Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (ns nicht signifikant, **P < 0,01, ***P < 0,001, ungepaarter t-Test; zweiseitig).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Häm und Hz werden mit der Funktion von Malariamedikamenten – Artemisinin und Chloroquin – in Verbindung gebracht44,45.Daher waren wir daran interessiert, die Wirkung von α,β-Arteether (Artemisinin-Derivat) und Chloroquin auf FCKO-infizierte C57BL/6-Mäuse in vivo zu untersuchen.Für die Behandlung mit α,β-Arteether wurde eine einzelne intramuskuläre Dosis von 1 mg/Maus oder 0,4 mg/Maus am Tag 5 nach der Infektion verabreicht, als die Blutparasitämie etwa 5 % betrug.Für die Behandlung mit Chloroquin wurde eine Tagesdosis von 25 mg/kg oder 10 mg/kg intraperitoneal an fünf aufeinanderfolgenden Tagen ab dem 5. Tag nach der Infektion verabreicht.Während 1 mg α,β-Arteether die WT- und FCKO-Parasiten beseitigen konnte, wurde bei WT- und FCKO-infizierten Mäusen bei einer Dosierung von 0,4 mg ein Wiederaufflammen von 50 % beobachtet.Der Tag des erneuten Auftretens war zwischen WT- und FCKO-Parasiten vergleichbar, und die Parasiten waren in peripheren Abstrichen nachweisbar, die am Tag 12 nach der Infektion hergestellt wurden.Allerdings war das Wachstum von FCKO-Parasiten bei Mäusen, die ein Wiederauftreten zeigten, in den darauffolgenden Tagen verzögert, was sich in der Sterblichkeit widerspiegelte (Abb. 6a, b).Die Bewertung der Parasitenlast zum Zeitpunkt des erneuten Auftretens an Tag 12 unter Verwendung von PbGAPDH-Primern zeigte, dass die gegen Maus-GAPDH normalisierten Ct-Werte bei FCKO-infizierten Mäusen ~ 1,5 Zyklen höher waren als bei WT-infizierten Mäusen (ergänzende Abb. 4a – d), was auf 3 hindeutet -mal weniger Parasitenbelastung bei FCKO-infizierten Mäusen.Im Falle von Chloroquin wurde bei beiden getesteten Dosen ein Wiederaufflammen von WT- und FCKO-Parasiten beobachtet, und was wichtig ist, FCKO-Parasiten traten 2–4 Tage früher auf als WT (Abb. 6c, d).Dies wurde auch durch die Durchführung einer qPCR-Analyse an Tag 13 für 25-mg/kg- und an Tag 10 für 10-mg/kg-Dosen bestätigt.In beiden Fällen waren die für die Parasitenbelastung bei FCKO-infizierten Mäusen erhaltenen Ct-Werte ~ 4 Zyklen niedriger als bei WT-infizierten Mäusen, was auf eine 16-fach höhere Parasitenbelastung bei FCKO-infizierten Mäusen hindeutet (Ergänzende Abb. 4e – h).Außerdem starb eine von vier und zwei von vier WT-infizierten Mäusen an CM bei einer Behandlung mit 25 mg/kg bzw. 10 mg/kg.Obwohl sie ein frühes Wiederauftreten zeigten, starben alle FCKO-infizierten Mäuse an Anämie und ihre Sterblichkeit war im Vergleich zu WT-infizierten Mäusen verzögert (Fig. 6d).Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Chloroquin-Empfindlichkeit bei FCKO-Parasiten beeinträchtigt ist, wie durch das frühere Wiederaufflammen beobachtet wurde, während die α,β-Arteether-Empfindlichkeit in vivo bei Mäusen unverändert bleibt.a, b Blutparasitämie- bzw. Sterblichkeitskurven von infizierten Mäusen, die mit α,β-Arteether behandelt wurden.Die Daten repräsentieren vier Mäuse für jede Gruppe (ns nicht signifikant, Log-Rank (Mantel-Cox)-Test).c, d Blutparasitämie bzw. Sterblichkeitskurven von mit Chloroquin behandelten infizierten Mäusen.Die Daten repräsentieren vier Mäuse für jede Gruppe (**P < 0,01, Log-Rank (Mantel-Cox)-Test).Für (a, c) repräsentieren die Daten den Mittelwert ± Standardabweichung.Einzelne Datenpunkte werden mit den jeweiligen hell schattierten Farben dargestellt.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der verringerten Hz-Synthese zugrunde liegen, haben wir den pH-Wert, die Lipide und den Proteingehalt der FVs in FCKO-Parasiten bewertet und mit WT-Parasiten verglichen.Live-Fluoreszenz-Bildgebung von pRBCs, die mit dem acidophilen Farbstoff LysoTracker Deep Red inkubiert wurden, zeigte eine geringere Fluoreszenz bei den FCKO-Parasiten (Abb. 7a), was darauf hindeutet, dass der pH-Wert von FCKO-FV beeinträchtigt ist.Die Quantifizierung der Fluoreszenzsignalintensitäten zeigte eine Abnahme von ~50 % (Abb. 7b).Wir untersuchten den Phospholipidgehalt und konnten keine signifikanten Unterschiede für die In-vitro-32P-Orthophosphorsäure-Radiomarkierung der wichtigsten Phospholipide – Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylethanolamin (PE) – in der Gesamtzahl der Parasiten und FVs von FCKO-Parasiten finden (Abb. 7c, d und ergänzende Abb. 5a).Ebenso zeigte die Bewertung des neutralen Lipidgehalts durch Live-Fluoreszenz-Bildgebung von mit BODIPY 493/503 und Nile Red gefärbten pRBCs keine signifikanten Unterschiede (Abb. 7e–h).Es wird berichtet, dass mit Parasiten-Hz assoziierte Lipide in Monohydroxyderivaten von polyenischen Fettsäuren reichlich vorhanden sind, und ungesättigte Glycerophospholipide induzieren eine schnelle und effiziente Hz-Bildung im hämatophagen Insekt Rhodnius prolixus46,47.Die GC-MS-Analyse von Fettsäuremethylestern (FAMEs), die aus FVs von Pb-Parasiten hergestellt wurden, zeigte das Vorhandensein von Ölsäure (OA) als wichtigste ungesättigte Fettsäure, gefolgt von Arachidonsäure zusammen mit anderen gesättigten Fettsäuren, Fettacylalkoholen und Derivaten , Alkane usw. (Ergänzende Abb. 5b und Ergänzende Tabelle 1).Malariaparasiten fangen Stearinsäure (SA) aus dem Plasma auf und wandeln sie durch ER-lokalisierte Δ9-Desaturase (Stearoyl-CoA 9-Desaturase) in OA um.Die cis-Doppelbindungsbildung in OA erfordert Häm, da es die Elektronen verwendet, die durch Cytochrom b5 von der NADH-Cytochrom-b5-Reduktase übertragen werden48,49.Wir führten eine In-vitro-14C-SA-Radiomarkierung durch, um die vom Parasiten synthetisierte OA zu beurteilen.Die Trennung von ungesättigten FAMEs, die aus FCKO-Gesamtparasiten und FVs hergestellt wurden, zeigte eine fast 80–90%ige Abnahme der radioaktiven Markierung von OA-Methylester (OAME) im Vergleich zu WT (Abb. 8a–c), ohne signifikante Unterschiede in den Signalintensitäten von SA-Methylester (GLEICH).Die Identität des langsamer migrierenden mehrfach ungesättigten FAME (PU-FAME), das ebenfalls eine signifikante Abnahme der FVs zeigte, muss noch ermittelt werden, und es gibt keine eindeutigen Beweise für das Vorhandensein anderer Desaturasen im Parasiten.n = 3 unabhängige Experimente.n = 3 unabhängige Experimente.n = 3 unabhängige Experimente.n = 3 unabhängige Experimente.n = 3 unabhängige Experimente.Med.Int.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarVorderseite.Artikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarNat.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarArtikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarVorderseite.Artikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarVorderseite.Artikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarVorderseite.Nat.Med.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarMed.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarMed.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarMed.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarDis.Artikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarArtikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarAuflösungArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarChem.Artikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarNat.Med.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarChem.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarNat.Proz.Natl. Acad.Wissenschaft.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed CAS Google ScholarAppl.Chem.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed Central CAS Google ScholarChem.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarWissenschaft.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarProz.Natl. Acad.Wissenschaft.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarWissenschaft.Erw.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarWissenschaft.Artikel CAS PubMedGoogle Scholarbiol.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenHinweis des Herausgebers Springer Nature bleibt neutral in Bezug auf Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt